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　1 范圍
　　
　　本標準規(guī)定了雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）菌種的質(zhì)量要求、試驗方法、檢驗規(guī)則及標簽、標志、包裝、貯運等。本標準適用于雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）的生產(chǎn)、流通和使用。
　　
　　2 引用標準
　　
　　下列標準所包含的條文，通過在本標準中引用而構(gòu)成為本標準的條文。在本標準出版時，所示版本均為有效。所有標準都會被修訂，使用本標準的各方應(yīng)探討使用下列標準最新版本的可能性。
　　GB191－1990 包裝儲運圖示標準
　　GB4789.28－1994　食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗　染色法、培養(yǎng)基和試劑
　　GB9687－1988 食品包裝用聚乙烯成型品衛(wèi)生標準
　　GB9688－1988 食品包裝用聚丙烯成型品衛(wèi)生標準
　　GB/T12728－1991　食用菌術(shù)語
　　
　　3 定義
　　
　　本標準采用下列定義。
　　
　　3.1 母種　stock culture
　　
　　經(jīng)各種方法分離、選育或雜交得到的具有出菇能力的菌絲體純培養(yǎng)物及其繼代培養(yǎng)物。
　　
　　3.2 原種 pre-culture spawn
　　
　　由母種移植、擴大培養(yǎng)而成的菌絲體純培養(yǎng)物。栽培種 spawn由原種移植、擴大培養(yǎng)而成的菌絲體純培養(yǎng)物。
　　3.4 拮抗現(xiàn)象 antagonism
　　
　　具有不同遺傳基因的菌落間產(chǎn)生不生長區(qū)帶或形成不同形式線形邊緣的現(xiàn)象。
　　
　　3.5 無棉塑料蓋 plastic stop
　　
　　可代替塑料蓋，帶有某種高分子或纖維材料可滿足濾菌和透氣要求的塑料蓋。
　　
　　3.6 玻璃菌種瓶 glass spawn bottle
　　
　　圓柱形，容積750mL，耐126℃高溫，無色、淡綠色或淡蘭色的透明玻璃瓶。瓶體總高190mm±2mm，瓶頸高25mm±1mm，瓶口外徑40mm±1mm，瓶體外徑82mm±1mm。
　　
　　3.7 塑料菌種瓶 polypropylene spawn bottle
　　
　　圓柱形，容積850mL，耐126℃高溫，白色、半透明，衛(wèi)生標準符合GB9688規(guī)定的塑料瓶。瓶體總高165mm±2mm，瓶頸高28mm±1mm，瓶口外徑63mm±1mm，瓶體外徑90mm±1mm。
　　
　　3.8 角變 sector
　　
　　因菌絲體局部變異或感染病毒而導(dǎo)致菌絲變細、生長緩慢、菌絲體表面特征成角狀異常的現(xiàn)象。
　　
　　3.9 高溫抑制線 high temperatured line
　　
　　食用菌菌種在生長過程中受高溫的不良影響，培養(yǎng)物出現(xiàn)的圈狀發(fā)黃、發(fā)暗或菌絲變稀弱的現(xiàn)象。
　　
　　3.10 同工酶 isoenzyme
　　
　　催化相同生化反應(yīng)，而結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)不同的酶分子。通過凝膠電泳使同工酶分離成遷移率不同的區(qū)帶，經(jīng)生物化學(xué)染色后顯示出的同工酶譜，可對生物品種進行酶分子水平的鑒別或鑒定。
　　
　　4 質(zhì)量要求
　　
　　4.1母種
　　
　　4.1.1　容器規(guī)格 采用18 mmX180mm、20mm X200mm的玻璃試管。
　　
　　4.1.2　培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基），按GB4789.28中4.79規(guī)定配置。
　　
　　4.1.3感官指標 符合表1規(guī)定。
　　
　　表1
　　
　　項目要求
　　棉塞或無棉塑料蓋干燥、潔凈、松緊適度，能滿足透氣和濾菌要求
　　培養(yǎng)基灌入量 為試管總體積的十分之一至五分之一
　　培養(yǎng)基斜面長度為試管總長度的二分之一至五分之一
　　斜面接種塊大小 3~5mmX3~5mm
　　
　　培養(yǎng)基斜面 正面外觀
　　菌絲體特征 潔白或米白、濃密、羽毛狀或葉脈狀
　　菌絲體表面 均勻、平整、無角變
　　菌絲分泌物 無
　　菌落邊緣整齊，無膏狀、蠟狀細菌或酵母菌菌落及霉菌菌落
　　培養(yǎng)基斜面背面外觀 培養(yǎng)基不干縮，顏色均勻、無暗斑、無色素
　　培養(yǎng)物氣味有雙孢蘑菇菌種特有的香味，無酸、臭、霉等異味
　　培養(yǎng)物鏡檢 菌絲粗壯，無雜菌菌絲及孢子，無蟲及蟲卵。
　　
　　4.1.4　菌絲生長速度 在適溫（24℃±1℃）下，15－20天長滿試管。
　　
　　4.1.5 母種遺傳和栽培性狀 供種單位，母種需經(jīng)酯酶(Est)同工酶類型鑒定，確認其遺傳類型與對照相同后，需再經(jīng)出菇試驗確定產(chǎn)量及品質(zhì)等栽培農(nóng)藝性狀合格后，方可用于擴大繁殖或出售。
　　
　　4.1.5.1菌絲體Est同工酶的聚丙烯酰胺凝膠電泳類型 包括G型(呈現(xiàn)e1,e3特征帶)、H型(呈現(xiàn)e2,e4和e30-33特征帶)、HG1~HG2型(呈現(xiàn)e1,e3,e30-33特征帶)和HG4型(呈現(xiàn)e1,2,3,4和e30-33特征帶)等。以Est區(qū)帶向正極泳動距離與溴酚藍指示劑向正極泳動距離的比值作為電泳相對遷移率(Rm)。e1,e2,e3,e4,e30,e31,e32和e33的Rm值分別為0.820,0.810,0.760,0.750,0.128,0.100,0.070和0.010。
　　
　　4.1.5.2 菌絲萌發(fā)、定植能力 接種到適合的培養(yǎng)基后，在正常條件下24小時內(nèi)萌發(fā)恢復(fù)，定植迅速、菌絲健壯，20天以內(nèi)長滿培養(yǎng)基。
　　
　　4.1.5.3 結(jié)菇轉(zhuǎn)潮能力 覆土后12～16天結(jié)菇，分布均勻；18～22天采菇，每潮菇間隔7～10天。
　　
　　4.1.5.4 抗逆性 對溫度、濕度、酸堿度等生長條件變化耐受能力較強；對主要病蟲害的抵抗能力較強。
　　
　　4.1.5.5 生物學(xué)效率 在正常條件下生物學(xué)效率不低于30%。
　　
　　4.2　原種
　　
　　4.2.1　容器規(guī)格 玻璃菌種瓶或塑料菌種瓶，分別符合3.6和3.7規(guī)定。
　　
　　4.2.2　培養(yǎng)基
　　
　　4.2.2.1　腐熟麥桿或稻桿(干)77%，腐熟牛糞粉(干)20%,石膏粉1%,碳酸鈣2%,含水量62%±1%,pH7.5。
　　4.2.2.2 腐熟棉籽殼（干）97%，石膏粉1%, 碳酸鈣2%, 含水量55%±1%, pH7.5。
　　
　　4.2.3　感官指標 符合表2規(guī)定。
　　
　　表2
　　
　　項目 要求
　　棉塞或無棉塑料蓋 干燥、潔凈、松緊適度，能滿足透氣和濾菌要求
　　培養(yǎng)基上表面距瓶口的距離 50 mm±5mm
　　接種量 每支母種接原種 4－6瓶
　　菌種瓶外觀
　　菌絲體特征 潔白濃密、生長旺健
　　培養(yǎng)物表面菌絲體生長均勻，無角變，無高溫抑制線
　　培養(yǎng)基及菌絲體緊貼瓶壁，無干縮
　　培養(yǎng)物表面分泌物 無
　　各種雜菌孢子、菌絲 無
　　拮抗現(xiàn)象 無
　　培養(yǎng)物氣味 有蘑菇菌種特有的香味，無酸、臭、霉等異味
　　培養(yǎng)物鏡檢 菌絲粗壯、無雜菌菌絲和孢子、無蟲及蟲卵
　　
　　4.2.4菌絲生長速度：原種瓶應(yīng)發(fā)滿菌絲，在適溫（24℃±1℃）下菌絲長滿瓶不超過45天。
　　
　　4.3 栽培種
　　
　　4.3.1　容器規(guī)格： 玻璃菌種瓶或塑料菌種瓶，也可采用不小于15cm×28cm，厚0.04mm-0.06mm的聚丙烯塑料袋。塑料袋的衛(wèi)生標準符合GB9687和GB9688規(guī)定。
　　
　　4.3.2　培養(yǎng)基 除同4.2.2.1和4.2.2.2外，另可用以下兩種。
　　
　　4.3.2.1 谷粒98%，石膏粉2%, 含水量50%±1%, pH7.5～8.0。
　　
　　4.3.2.2 其它經(jīng)省級或省級以上鑒定適合于雙孢蘑菇菌絲生長的培養(yǎng)基。
　　
　　4.3.3感官指標 符合表3規(guī)定。
　　
　　表3
　　
　　項目要求
　　棉塞或無棉塑料蓋 干燥、潔凈、松緊適度，能滿足透氣和濾菌要求
　　培養(yǎng)基面距瓶（袋）口的距離 50 mm±5mm
　　接種量 每瓶原種接栽培種 30－50瓶（袋）
　　菌種瓶（袋） 外觀
　　菌絲體特征 潔白濃密、生長旺健
　　不同部位菌絲體 生長均勻，無角變，無高溫抑制線
　　培養(yǎng)基及菌絲體 緊貼瓶（袋）壁，無干縮
　　培養(yǎng)物表面分泌物 無
　　各種雜菌孢子、菌絲 無
　　拮抗現(xiàn)象 無
　　培養(yǎng)物氣味 有蘑菇菌種特有的香味，無酸、臭、霉等異味
　　培養(yǎng)物鏡檢 菌絲粗壯、無雜菌菌絲和孢子、無蟲及蟲卵
　　
　　4.3.4 菌絲生長速度 栽培種瓶（袋）應(yīng)發(fā)滿菌絲，在適溫（24℃±1℃）下菌絲長滿菌種瓶（袋）不超過45天。
　　
　　4.3.5 種源 應(yīng)使用通過省級或省級以上菌種審定委員會審定、認定或登記的品種，并從具有相應(yīng)技術(shù)資質(zhì)的供種單位引種。
　　
　　5 抽樣
　　
　　5.1質(zhì)檢部門的抽樣應(yīng)具有代表性。
　　
　　5.2母種按品種、培養(yǎng)條件、接種時間分批編號，原種、栽培種按菌種來源、制種方法和接種時間分批編號。按批隨機抽取被檢樣品。
　　
　　5.3母種、原種、栽培種的抽樣量分別為該批菌種量的10%，5%，1%。但每批抽樣數(shù)量不得少于10支、瓶（袋）；超過100支、瓶（袋）的，可進行兩級抽樣。
　　
　　6 試驗方法
　　
　　6.1 感官檢驗
　　
　　6.1.3表1、表2、表3中除接種量、培養(yǎng)物氣味和培養(yǎng)物鏡檢三項外的各項，用肉眼或5X放大鏡觀察。
　　
　　6.1.4表1、表2、表3中培養(yǎng)物氣味，以鼻嗅判斷。
　　
　　6.1.5表1、表2、表3中培養(yǎng)物鏡檢，用放大倍數(shù)不低于10X40的光學(xué)顯微鏡對培養(yǎng)物的水封片進行觀察，每一檢樣應(yīng)觀察不少于30個視野。
　　
　　6.1.6表2、表3中接種量，需察看菌種廠的生產(chǎn)紀錄。
　　
　　6.2細菌檢驗
　　
　　取少量疑有細菌污染的培養(yǎng)物，按無菌操作接入GB4789.28中4.8規(guī)定的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，25℃-28℃振蕩培養(yǎng)1－2天，觀察培養(yǎng)液是否混濁。培養(yǎng)液混濁，為有細菌污染；培養(yǎng)液澄清，為無細菌污染。
　　
　　6.3母種遺傳和栽培性狀檢驗
　　
　　6.3.1 Est同工酶鑒定
　　
　　取菌齡為15-20天的試管母種, 刮取菌絲, 按1:3:0.5的比例混合菌絲(g)、0.1Mol/L磷酸緩沖液(mL)和石英砂(g), 研磨成勻漿, 臺式離心機10000r/min離心5min, 取上清液, 按5:1:1的比例混合上清液、40%蔗糖和0.01%溴酚藍溶液作為電泳樣品, 4℃下冷藏備用。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳。用pH8.9Tris-HCl緩沖液配制9%分離膠,用pH8.3Tris-甘氨酸作電極緩沖液。點樣75uL, 3℃下120V電泳20min后穩(wěn)壓200V, 4h。用固藍RR鹽60mg, 0.1Mol/L磷酸緩沖液(pH6.0) 80mL α-萘乙酯38mg和β-萘乙酯38mg溶于3mL丙酮配制的染色液染色,顯現(xiàn)酶譜,再根據(jù)特征帶分型。
　　
　　6.3.2 栽培性狀
　　
　　將被檢母種制成原種。采用4.2.2.1的培養(yǎng)基配方（含水量提高到68%），配制360千克培養(yǎng)基, 接種后分3組(每組2M2)進行常規(guī)管理，根據(jù)表4所列項目，做好栽培記錄，統(tǒng)計檢驗結(jié)果。同時將該母種的出發(fā)菌株設(shè)為對照，亦做同樣處理。對比二者的檢驗結(jié)果，以時間計的檢驗項目中，被檢母種的任何一項時間較對照菌株推遲5天以上（含5天）者，為不合格；產(chǎn)量性狀差異顯著低于對照菌株者，為不合格；菇體外觀形態(tài)與對照明顯不同或畸形者，為不合格。
　　
　　表4
　　
　　檢驗項目 檢驗結(jié)果 檢驗項目 檢驗結(jié)果
　　母種發(fā)滿所需時間，天
　　轉(zhuǎn)潮間隔時間，天
　　原種發(fā)滿所需時間，天
　　總產(chǎn)，Kg
　　栽培種發(fā)滿所需時間，天
　　平均單產(chǎn)，Kg
　　菌種萌發(fā)所需時間，天
　　平均單菇重，g
　　菌絲發(fā)滿培養(yǎng)基所需時間，天
　　生物學(xué)效率，%
　　覆土至扭結(jié)所需時間，天
　　菇型、色澤
　　覆土至采菇所需時間，天
　　菇蓋直徑、厚度、柄長、柄的直徑，mm
　　
　　6.4留樣
　　
　　各級菌種要留樣備查，留樣的數(shù)量應(yīng)每個批號母種3-5支，原種和栽培種5-7瓶，于4℃-6℃下貯存，母種5個月，原種4個月，栽培種2個月。
　　
　　7 檢驗規(guī)則
　　
　　7.1判定規(guī)則按質(zhì)量要求進行。檢驗項目全部符合質(zhì)量要求時，為合格菌種，其中任何一項不符合要求，均為不合格菌種。
　　
　　8 標志、包裝、運輸、貯存
　　
　　8.1標志
　　
　　8.1.1產(chǎn)品標志 每支、瓶（袋）菌種要貼有清晰注明以下要素的標志。
　　
　　a. 產(chǎn)品名稱（雙孢蘑菇母種）
　　b. 品種名稱（As2796）
　　c. 生產(chǎn)單位（xxx菌種廠）
　　d. 接種日期（2000.xx.xx）
　　
　　8.1.2包裝標志 每箱菌種要貼有清晰注明以下要素的包裝標志。
　　
　　a. 產(chǎn)品名稱、品種名稱
　　b. 廠名、廠址、聯(lián)系電話
　　c. 出廠日期
　　d. 保質(zhì)期、貯存條件、執(zhí)行標準
　　e. 發(fā)貨單位
　　f.收貨單位
　　g. 數(shù)量
　　h. 毛重、凈重
　　i. 執(zhí)行標準
　　
　　8.1.3 包裝儲運圖示 按GB191規(guī)定，應(yīng)注明以下圖示標志：
　　
　　a. 小心輕放標志
　　b.防水防潮防凍標志
　　c.防曬防高溫標志
　　d.防止倒置標志
　　e.防止重壓標志
　　
　　8.2 包裝
　　
　　8.2.1　母種外包裝采用木盒或有足夠強度的紙材制做的紙箱，內(nèi)部用棉花、碎紙、報紙等具有緩沖作用的輕質(zhì)材料填滿。
　　
　　8.2.2　原種、栽培種外包裝采用有足夠強度的紙材制做的紙箱，每箱20瓶，內(nèi)部用碎紙、報紙等具有緩沖作用的輕質(zhì)材料填滿。紙箱上部和底部用8cm寬的膠帶封口，并用打包帶捆扎兩道，箱內(nèi)附產(chǎn)品合格證書和使用說明（包括菌種種性、培養(yǎng)基配方及適用范圍）。
　　
　　8.3　運輸
　　
　　8.3.1　不得與有毒物品混裝。
　　
　　8.3.2　氣溫達30℃以上時，需用2℃-20℃的冷藏車運輸。
　　
　　8.3.3　運輸中須有防震、防曬、防雨淋、防凍、防雜菌污染的措施。
　　
　　8.4 貯存
　　
　　8.4.1　母種一般在5℃±1℃冰箱中貯存，保藏期不超過90天。
　　
　　8.4.2　原種應(yīng)盡快使用，10天內(nèi)可在溫度24℃±1℃、清潔、通風、干燥(相對濕度70%-75%)、 避光的室內(nèi)存放。在5℃±1℃下貯存，保藏期不超過40天。
　　
　　8.4.3 栽培種應(yīng)盡快使用，在溫度24℃±1℃、清潔、通風、干燥(相對濕度70%-75%)、 避光的室內(nèi)存放谷粒種不超過10天，其余培養(yǎng)基的栽培種不超過20天。在5℃±1℃下可貯存90天。